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doi: 10.3732/apps.1300070
Roxana Yockteng, Ana M. R. Almeida, Stephen Yee, Thiago Andre, Colin Hill, and Chelsea D. Specht
Premise of the study: To study gene expression in plants, high-quality RNA must be extracted in quantities sufficient for subsequent cDNA library construction. Field-based collections are often limited in quantity and quality of tissue and are typically preserved in RNAlater. Obtaining sufficient and high-quality yield from variously preserved samples is essential to studies of comparative biology. We present a protocol for the extraction of high-quality RNA from even the most recalcitrant plant tissues.
Methods and Results: Tissues from mosses, cycads, and angiosperm floral organs and leaves were preserved in RNAlater or frozen fresh at −80°C. Extractions were performed and quality was measured for yield and purity.
Conclusions: This protocol results in the extraction of high-quality RNA from a variety of plant tissues representing vascular and nonvascular plants. RNA was used for cDNA synthesis to generate libraries for next-generation sequencing and for expression studies using quantitative PCR (qPCR) and semiquantitative reverse transcription PCR (RT-PCR).
Materials and Methods
Sampling — Plant material was collected from greenhouses and botanical gardens ( Table 1 ) and either stored in RNA later (Ambion, Carlsbad, California, USA) or frozen immediately in liquid nitrogen. reserved tissue was placed in long-term storage at −80 ° C. For storage in RNA later , approximately 3 × the volume of RNA later : tissue is used. Tissue stored in RNA later and frozen (−80 ° C) was defrosted just enough to remove the tissue from the RNA later prior to extraction.
Basic protocol — The following protocol was modified from the manufacturer’s provided instructions for effective use of the Plant RNA Reagent from Life Technologies. As indicated, all solutions are prepared with sterile RNase-free water, and all supplies and handling materials are cleaned with RNase AWAY (Ambion) prior to dissection and storage. This protocol is optimized to isolate RNA from approximately 0.1 g of plant tissue. If the amount of plant tissue is increased, reagent volumes must be scaled appropriately.
Grinding the tissue— One of the critical points to obtain high yield in the extraction of genetic material is the grinding. It is essential to grind the tissue as finely as possible, maintaining samples as cold as possible during grinding to avoid degradation. Selection of FastPrep or mortars/pestle depends on the hardness of the tissue being processed.
A FastPrep FP120 Homogenizer (Thermo Savant, Carlsbad, California, USA) was used for grinding floral organs and soft leaf tissue. Approximately 0.1 g of frozen floral organs, whole flowers, and leaves or herbaceous stems were added to FastPrep 2-mL tubes (MP Biomedicals, Santa Ana, California, USA) 1/5 filled with bulk Lysing Matrix D (MP Biomedicals). FastPrep tubes containing the frozen tissue plus Lysing Matrix beads were shaken in the homogenizer (FastPrep) for 40 s at speed 6 (6 m/s) without buffer at room temperature.
For grinding hard tissue or ligneous tissue, such as cone scales from gymnosperms, the tissue was ground under liquid nitrogen in a mortar and pestle that was sterilized and baked (minimum 12 h at 150 ° C). The tissue was ground as finely as possible, and the powdered material was placed in a 1.5-mL tube. The manually ground sample can be added to the FastPrep tube with Lysing Matrix beads (see above) for additional pulverization.
RNA extraction— Once the tissue is sufficiently homogenized:
1. Add 0.6 mL of cold (4 °C) Plant RNA Reagent (Life Technologies) to pulverized tissue. Mix by brief vortexing or flicking the bottom of the tube until the sample is thoroughly resuspended. If tissue was ground with a FastPrep, homogenize with the cold buffer for an additional 40 s. If the tissue is not completely ground, repeat 1–2 × until the tissue is pulverized. If the tissue was ground with a mortar and pestle and does not need additional grinding, continue with the next step.
2. Incubate 5 min at room temperature. Placing the samples on a rotator or nutator will help to maximize surface area of the tissue with the extraction buffer.
3. Clarify the solution by centrifuging for 2 min at 12,000 × g in a microcentrifuge at room temperature. Transfer the supernatant to a tube with Phase Lock Gel (5 Prime, Gaithersburg, Maryland, USA). Although the Phase Lock Gel tubes are not required, they greatly facilitate separation of the organic and aqueous phases and help ensure cleanliness of the sample.
4. Add 0.1 mL of 5 M NaCl to the sample, tap tube to mix, and add 0.3 mL of chloroform–isoamyl alcohol (24 : 1). Mix thoroughly by inversion and centrifuge the sample at 4 ° C for 10 min at 12,000 × g to separate the phases. Transfer the aqueous (top) phase to an RNase-free tube.
5. Add to the aqueous phase an equal volume of a mix of LiCl (4 M) (3/4 v) and isopropyl alcohol (1/4 v). Mix and let stand at −20 ° C for 30 min to overnight. If the tissue was stored in RNA later , mix and let stand at −20 ° C for a maximum of 3 h (not overnight). If the precipitation is longer, salts from the RNA later solution could also precipitate. (Note: We have also let the sample stand at −80 ° C for 3 h, and this works as well.)
6. Centrifuge the sample at 4 ° C for 20 min at 12,000 × g .
7. Decant or remove supernatant with a pipette, taking care not to lose the pellet. Add 1 mL of 75% ethanol to the pellet. The pellet may be diffi cult to see. To help to see the pellet, you can add 1 μ L of GlycoBlue (Ambion) in step 5.
8. Centrifuge at 4 ° C for 5 min at 12,000 × g . Decant the liquid carefully, taking care not to lose the pellet. Briefly centrifuge to collect the residual liquid, and remove it with a pipette.
9. Let dry on ice for 15 min at room temperature and elute pellet in 10–30 μL of RNase-free water. Pipette the water up and down over the pellet to dissolve the RNA. If the pellet is difficult to dissolve, add more water or warm to 37 °C to facilitate the dissolution. It is important to resuspend the pellet completely to obtain an accurate measure of the concentration of your RNA. If the sample is not clean, it can be purified by the cleanup step suggested later. Although some protocols have suggested that performing an additional step of chloroform would clean the RNA samples (e.g., Accerbi et al., 2010 ), we found that an additional chloroform step decreases the RNA yield substantially.
A NanoDrop ND-1000 spectrophotometer (Thermo Scientific, Wilmington, Delaware, USA) can be used to verify the concentration and purity of the RNA obtained. To assess the presence and purity of extracted RNA, use the ratio of absorbance at 230 nm, 260 nm, and 280 nm. If the RNA is pure, we expect a 260/280 ratio around 2, although this ratio does not guarantee pure RNA (see below). If the ratio is appreciably lower, it is an indication of the presence of protein, phenol, or other contaminants that absorb strongly at or near 280 nm. The ratio 260/230 is expected to be around 2–2.2. If this value is appreciably lower, it is an indication that contaminants such as carbohydrates, EDTA, guanidine isothiocyanate, and phenol that absorb at 230 nm are present in the sample. Ratios lower than expected could indicate that additional cleaning is necessary and the optional cleanup should be followed. While a more accurate assessment of the quality will be determined with a bioanalyzer prior to sequencing, this initial NanoDrop read will provide an indication of the presence of RNA, enabling the researcher to continue.
Optional cleanup — If the sample is not clean, the following modified cleanup procedure will help to purify the total RNA. This protocol is adapted from that published for DNA cleanup by Rohland and Reich (2012) , using magnetic beads to capture nucleotide material and permit additional washing steps that aid in the removal of undesirable metabolites. All stock solutions and reagents must be prepared with RNase-free water.
Preparing Sera-Mag beads solution— Begin by preparing 50 mL of SeraMag beads. Add 9 g of PEG-8000, 10 mL of 5 M NaCl, 500 μ L of 1 M Tris-HCl (pH 8.0), and 100 μ L of 0.5 M EDTA (pH 8.0) to a 50-mL Falcon tube. Add 1 mL (9 g) of the carboxyl-modified Sera-Mag Magnetic SpeedBeads (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts, USA; cat. no. 09-981-123) to a 1.5-mL tube. Pellet the beads for 5 min with a magnetic stand designed for 1.5–2-mL tubes. Remove the storage buffer, leaving the tubes in the magnetic stand. Wash beads 1 × with 1 mL TE or water. Remove the tube from the magnetic stand and immediately re-suspend the beads in an additional 1 mL TE or water.
Add the bead suspension to the prepared 50-mL Falcon tube and wrap the Falcon tube with aluminium foil. Store at 4 ° C for further use. The final concentration of the bead solution is 0.1% carboxyl-modified Sera-Mag Magnetic SpeedBeads, 18% PEG-8000 (w/v), 1 M NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH 8.0), and 0.05% Tween 20.
RNA cleanup— Bring a measured amount of prepared Sera-Mag beads solution to room temperature at least 30 min prior to use. For maximum binding, measure out 3 × the total RNA volume of the beads solution and place into a 1.5-mL tube along with the RNA. Place tubes on a rotator at room temperature for 10 min.
Spin the beads solution down before the beads dry permanently onto the wall of the tube. The beads must be spun down very quickly and at low speed to avoid bead precipitation; a mini benchtop centrifuge is recommended, with a spin so quick such that the lid does not need to be closed. Incubate without rotating at room temperature for an additional 10 min to maximize RNA binding. Place the 1.5-mL tubes in the magnetic stand for 5 min, then remove the buffer with a pipette and wash the beads 2 × with 500 μ L of fresh 80% ethanol. After the second wash, remove all ethanol and make sure that no ethanol is left in the samples. Remove the tubes from the magnetic stand and spin beads down from the sides of the wall before they dry. Air-dry the bead pellet for 10 min. Elute with RNase-free water using approximately the same volume as your original sample of RNA.
Vortex beads and water just to mix, and spin down quickly at low speed as before. Place tubes on a rotator at room temperature for 2–5 min for maximum RNA elution, and spin down quickly. Place tubes in the magnetic stand. Let stand for 5 min and recover eluted RNA in a separate tube.
A NanoDrop measure is recommended to check quality and yield of RNA.
Zhang et al (2012)开发了一款很强大的进化树编辑、管理的在线服务程序，EvolView。EvolView是一个进化树可视化的软件，同时可以做各种编辑和处理，同时还支持额外增加一些数据上去，譬如把进化树和其他的表格数据关联起来等。最喜欢的另外一点，他是我目前用到的可视化编辑软件中，画出来的图形最漂亮的。EvolView支持一些列的数据格式例如，Newick, Nexus, Nhx and PhyloXML。图片可以导出高质量的PNG,JPEG,SVG等图片。
EvolView在线网站地址：http://www.evolgenius.info/evolview.html
EvolView, an online tool for visualizing, annotating and managing phylogenetic trees
Huangkai Zhang, Shenghan Gao, Martin J. Lercher, Songnian Hu1, and Wei-Hua ChenEvolView is a web application for visualizing, annotating and managing phylogenetic trees. First, EvolView is a phylogenetic tree viewer and customization tool; it visualizes trees in various formats, customizes them through built-in functions that can link information from external datasets, and exports the customized results to publication-ready figures. Second, EvolView is a tree and dataset management tool: users can easily organize related trees into distinct projects, add new datasets to trees and edit and manage existing trees and datasets. To make EvolView easy to use, it is equipped with an intuitive user interface. With a free account, users can save data and manipulations on the EvolView server. EvolView is freely available at: http://www.evolgenius.info/evolview.html.
Nucleic Acids Research 40, W569-W572.
doi: 10.1093/nar/gks576
Original TexT from PLoB
BioData Mining 2012, 5:7 doi:10.1186/1756-0381-5-7 PDF
Published: 16 July 2012
Ima Zainuddin, Kim Schlegel, Wilhelm Gruissem and Herve Vanderschuren
Plant Methods 2012, 8:24. doi: 10.1186/1746-4811-8-24 PDF
Recent progress in cassava transformation has allowed the robust production of transgenic cassava even under suboptimal plant tissue culture conditions. The transformation protocol has so far been used mostly for the cassava model cultivar 60444 because of its good regeneration capacity of embryogenic tissues. However, for deployment and adoption of transgenic cassava in the field it is important to develop robust transformation methods for farmer- and industry-preferred landraces and cultivars. Because dynamics of multiplication and regeneration of embryogenic tissues differ between cassava genotypes, it was necessary to adapt the efficient cv. 60444 transformation protocol to genotypes that are more recalcitrant to transformation. Here we demonstrate that an improved cassava transformation protocol for cv. 60444 could be successfully modified for production of transgenic farmerpreferred cassava landraces. The modified transformation method reports on procedures for optimization and is likely transferable to other cassava genotypes reportedly recalcitrant to transformation provided production of high quality friable embryogenic callus (FEC). Because the three farmer-preferred cassava landraces selected in this study have been identified as resistant or tolerant to cassava mosaic disease (CMD), the adapted protocol will be essential to mobilize improved traits into cassava genotypes suitable for regions where CMD limits production.
Figure 1 Primary somatic embryos of cassava genotypes: A. cv. 60444, B. 2ndAgric, C. Oko-iyawo, D. Abbey-ife
Figure 2 Proliferating FEC from cassava genotypes: (A) cv. 60444, (B) 2ndAgric, (C) Oko-iyawo, (D) Abbey-ife
Figure 5 GUS staining of transformed cassava landraces: (A) cv. 60444, (B) 2ndAgric, (C) Oko-iyawo, (D) Abbey-ife
RPKM, Reads Per Kilobase of exon model per Million mapped reads, is defined in this way [Mortazavi et al., 2008]: 
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RNA-seq是透过次世代定序的技术来侦测基因表现量的方法，在衡量基因表现量时，若是单纯以map到的read数来计算基因的表现量，在统计上是一件相当不合理事，因为在随机抽样的情况下，序列较长的基因被抽到的机率本来就会比序列短的基因较高，如此一来，序列长的基因永远会被认为表现量较高，而错估基因真正的表现量，所以Ali Mortazavi等人在2008年提出以RPKM在估计基因的表现量。
RPKM是将map到基因的read数除以map到genome的所有read数(以million为单位)与RNA的长度(以KB为单位)。
其公式为:
其中，total exon reads / mapped reads (millions) 可以视为所有read 数中有百分之多少是map 到这个基因，然后再除以基因长度，就可以某基因得到单位长度有百分之多少的total mapped read 有表现。
以下就用一个简化的例子来说明RPKM的运用方式与概念:
假设一基因体只有两个基因，一个9 KB，一个1 KB，如今有一sample，其map 到9 KB 的read 有18 million 个，map 到1 KB 的有2 million 个，如下图所示。
对于9 KB 的基因而言，
Total exon reads=18 million
Mapped reads=18+2=20 million
Exon length=9 KB
RPKM =18/(20*9)=0.1
对于1 KB 的基因而言，
Total exon reads=2 million
Mapped reads=18+2=20 million
Exon length=1 KB
RPKM =2/(20*1)=0.1
由此我们可以知道这两个基因表现量没有差别。
假设此时我们有另一个sample，其表现如下图所示:
我们可以发现此sample中9 KB基因的read数明显比上一个sample少，如果我们计算RPKM可以得到RPKM = 9/((9+1)*9)=0.1，却与上一个sample相同，这可能是因为cDNA浓度较低或是其他sample备制过程的问题，造成整体read变少，但是对9 KB基因而言，其read数占所有read数的比例并没有发生改变，所以其表现量会和上一个sample相同。
高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deep sequencing)。
de novo测序也称为从头测序：其不需要任何现有的序列资料就可以对某个物种进行测序，利用生物信息学分析手段对序列进行拼接，组装，从而获得该物种的基因组图谱。获得一个物种的全基因组序列是加快对此物种了解的重要捷径。随着新一代测序技术的飞速发展，基因组测序所需的成本和时间较传统技术都大大降低，大规模基因组测序渐入佳境，基因组学研究也迎来新的发展契机和革命性突破。利用新一代高通量、高效率测序技术以及强大的生物信息分析能力，可以高效、低成本地测定并分析所有生物的基因组序列。
全基因组重测序是对基因组序列已知的个体进行基因组测序，并在个体或群体水平上进行差异性分析的方法。随着基因组测序成本的不断降低，人类疾病的致病突变研究由外显子区域扩大到全基因组范围。通过构建不同长度的插入片段文库和短序列、双末端测序相结合的策略进行高通量测序，实现在全基因组水平上检测疾病关联的常见、低频、甚至是罕见的突变位点，以及结构变异等，具有重大的科研和产业价值。
外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
Small RNA（micro RNAs、siRNAs和 pi RNAs）是生命活动重要的调控因子，在基因表达调控、生物个体发育、代谢及疾病的发生等生理过程中起着重要的作用。Illumina能够对细胞或者组织中的全部Small RNA进行深度测序及定量分析等研究。实验时首先将18-30 nt范围的Small RNA从总RNA中分离出来，两端分别加上特定接头后体外反转录做成cDNA再做进一步处理后，利用测序仪对DNA片段进行单向末端直接测序。通过Illumina对Small RNA大规模测序分析，可以从中获得物种全基因组水平的miRNA图谱，实现包括新miRNA分子的挖掘，其作用靶基因的预测和鉴定、样品间差异表达分析、miRNAs聚类和表达谱分析等科学应用。
染色质免疫共沉淀技术（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）也称结合位点分析法，是研究体内蛋白质与DNA相互作用的有力工具，通常用于转录因子结合位点或组蛋白特异性修饰位点的研究。将ChIP与第二代测序技术相结合的ChIP-Seq技术，能够高效地在全基因组范围内检测与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段。
ChIP-Seq的原理是：首先通过染色质免疫共沉淀技术（ChIP）特异性地富集目的蛋白结合的DNA片段，并对其进行纯化与文库构建；然后对富集得到的DNA片段进行高通量测序。研究人员通过将获得的数百万条序列标签精确定位到基因组上，从而获得全基因组范围内与组蛋白、转录因子等互作的DNA区段信息。
基因表达谱(gene expression profile)：指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库,大规模cDNA测序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群体组成,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息,这样编制成的数据表就称为基因表达谱
成熟的microRNA（miRNA）是17~24nt的单链非编码RNA分子，通过与mRNA相互作用影响目标mRNA的稳定性及翻译，最终诱导基因沉默，调控着基因表达、细胞生长、发育等生物学过程。基于第二代测序技术的microRNA测序，可以一次性获得数百万条microRNA序列，能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的microRNA及其表达差异，为研究microRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。
转录组学（transcriptomics）是在基因组学后新兴的一门学科，即研究特定细胞在某一功能状态下所能转录出来的所有RNA（包括mRNA和非编码RNA）的类型与拷贝数。Illumina提供的mRNA测序技术可在整个mRNA领域进行各种相关研究和新的发现。mRNA测序不对引物或探针进行设计，可自由提供关于转录的客观和权威信息。研究人员仅需要一次试验即可快速生成完整的poly-A尾的RNA完整序列信息，并分析基因表达、cSNP、全新的转录、全新异构体、剪接位点、等位基因特异性表达和罕见转录等最全面的转录组信息。简单的样品制备和数据分析软件支持在所有物种中的mRNA测序研究。
功能基因组学（Functuional genomics）又往往被称为后基因组学（Postgenomics），它利用结构基因组所提供的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使得生物学研究从对单一基因或蛋白质得研究转向多个基因或蛋白质同时进行系统的研究。这是在基因组静态的碱基序列弄清楚之后转入对基因组动态的生物学功能学研究。研究内容包括基因功能发现、基因表达分析及突变检测。基因的功能包括：生物学功能，如作为蛋白质激酶对特异蛋白质进行磷酸化修饰；细胞学功能，如参与细胞间和细胞内信号传递途径；发育上功能，如参与形态建成等。采用的手段包括经典的减法杂交，差示筛选，cDNA代表差异分析以及mRNA差异显示等，但这些技术不能对基因进行全面系统的分析，新的技术应运而生，包括基因表达的系统分析（serial analysis of gene expression,SAGE），cDNA微阵列（cDNA microarray），DNA 芯片（DNA chip）和序列标志片段显示（sequence tagged fragments display。
比较基因组学(Comparative Genomics)是基于基因组图谱和测序基础上，对已知的基因和基因组结构进行比较，来了解基因的功能、表达机理和物种进化的学科。利用模式生物基因组与人类基因组之间编码顺序上和结构上的同源性，克隆人类疾病基因，揭示基因功能和疾病分子机制，阐明物种进化关系，及基因组的内在结构。
表观遗传学是研究基因的核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可遗传的变化的一门遗传学分支学科。表观遗传的现象很多，已知的有DNA甲基化（DNA methylation），基因组印记（genomic impriting），母体效应（maternal effects），基因沉默（gene silencing），核仁显性，休眠转座子激活和RNA编辑（RNA editing）等。
计算生物学是指开发和应用数据分析及理论的方法、数学建模、计算机仿真技术等。当前，生物学数据量和复杂性不断增长，每14个月基因研究产生的数据就会翻一番，单单依靠观察和实验已难以应付。因此，必须依靠大规模计算模拟技术，从海量信息中提取最有用的数据。
基因组印记(又称遗传印记)是指基因根据亲代的不同而有不同的表达。印记基因的存在能导致细胞中两个等位基因的一个表达而另一个不表达。基因组印记是一正常过程，此现象在一些低等动物和植物中已发现多年。印记的基因只占人类基因组中的少数，可能不超过5%，但在胎儿的生长和行为发育中起着至关重要的作用。基因组印记病主要表现为过度生长、生长迟缓、智力障碍、行为异常。目前在肿瘤的研究中认为印记缺失是引起肿瘤最常见的遗传学因素之一。
基因组学（英文genomics），研究生物基因组和如何利用基因的一门学问。用于概括涉及基因作图、测序和整个基因组功能分析的遗传学分支。该学科提供基因组信息以及相关数据系统利用，试图解决生物，医学，和工业领域的重大问题。
DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶的作用下，在基因组CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳位共价键结合一个甲基基团。正常情况下，人类基因组“垃圾”序列的CpG二核苷酸相对稀少，并且总是处于甲基化状态，与之相反，人类基因组中大小为100—1000 bp左右且富含CpG二核苷酸的CpG岛则总是处于未甲基化状态，并且与56％的人类基因组编码基因相关。人类基因组序列草图分析结果表明，人类基因组CpG岛约为28890个，大部分染色体每1 Mb就有5—15个CpG岛，平均值为每Mb含10．5个CpG岛，CpG岛的数目与基因密度有良好的对应关系[9]。由于DNA甲基化与人类发育和肿瘤疾病的密切关系，特别是CpG岛甲基化所致抑癌基因转录失活问题，DNA甲基化已经成为表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容。
基因组注释(Genome annotation) 是利用生物信息学方法和工具,对基因组所有基因的生物学功能进行高通量注释,是当前功能基因组学研究的一个热点。基因组注释的研究内容包括基因识别和基因功能注释两个方面。基因识别的核心是确定全基因组序列中所有基因的确切位置。
Sanger法测序利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每一次序列测定由一套四个单独的反应构成，每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)。由于ddNTP缺乏延伸所需要的3-OH基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在G、A、T或C处终止。终止点由反应中相应的双脱氧而定。每一种dNTPs和ddNTPs的相对浓度可以调整，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同的片段，凝胶处理后可用X-光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。
The object of differential 2D expression analysis is to find those spots which show expression difference between groups, thereby signifying that they may be involved in some biological process of interest to the researcher. Due to chance, there will always be some difference in expression between groups. However, it is the size of this difference in comparison to the variance (i.e. the range over which expression values fall) that will tell us if this expression difference is significant or not. Thus, if the difference is large but the variance is also large, then the difference may not be significant. On the other hand, a small difference coupled with a very small variance could be significant. We use the one way Anova test (equivalent t-test for two groups) to formalise this calculation. The tests return a p-value that takes into account the mean difference and the variance and also the sample size. The p-value is a measure of how likely you are to get this spot data if no real difference existed. Therefore, a small p-value indicates that there is a small chance of getting this data if no real difference existed and therefore you decide that the difference in group expression data is significant. By small we usually mean 0.05.
A positive is a significant result, i.e. the p-value is less than your cut off value, normally 0.05. A false positive is when you get a significant difference when, in reality, none exists. As I mentioned above, the p-value is the chance that this data could occur given no difference actually exists. So, choosing a cut off of 0.05 means there is a 5% chance that we make the wrong decision.
When we set a p-value threshold of, for example, 0.05, we are saying that there is a 5% chance that the result is a false positive. In other words, although we have found a statistically significant result, in reality, there is no difference in the group means. While 5% is acceptable for one test, if we do lots of tests on the data, then this 5% can result in a large number of false positives. For example, if there are 200 spots on a gel and we apply an ANOVA or t-test to each, then we would expect to get 10 false positives by chance alone. This is known as the multiple testing problem.
While there are a number of approaches to overcoming the problems due to multiple testing, they all attempt to assign an adjusted p-value to each test, or similarly, reduce the p-value threshold. Many traditional techniques such as the Bonferroni correction are too conservative in the sense that while they reduce the number of false positives, they also reduce the number of true discoveries. The False Discovery Rate approach is a more recent development. This approach also determines adjusted p-values for each test. However, it controls the number of false discoveries in those tests that result in a discovery (i.e. a significant result). Because of this, it is less conservative that the Bonferroni approach and has greater ability (i.e. power) to find truly significant results.
Another way to look at the difference is that a p-value of 0.05 implies that 5% of all tests will result in false positives. An FDR adjusted p-value (or q-value) of 0.05 implies that 5% of significant tests will result in false positives. The latter is clearly a far smaller quantity.
q-values are the name given to the adjusted p-values found using an optimised FDR approach. The FDR approach is optimised by using characteristics of the p-value distribution to produce a list of q-values. In what follows I will tie up some ideas and hopefully this will help clarify some of the ideas about p and q values.
It is usual to test many hundreds or thousands of spot variables in a proteomics experiment. Each of these tests will produce a p-value. The p-values take on a value between 0 and 1 and we can create a histogram to get an idea of how the p-values are distributed between 0 and 1. Some typical p-value distributions are shown below. On the x-axis we have histogram bars representing p-values. Each has a width of 0.05 and so in the first bar (red or green) we have those p-values that are between 0 and 0.05. Similarly, the last bar represents those p-values between 0.95 and 1.0, and so on. The height of each bar gives an indication of how many values are in the bar. This is called a density distribution because the area of all the bars always adds up to 1. Although the two distributions appear quite different, you will notice that they flatten off towards the right of the histogram. The red (or green) bar represents the significant values, if you set a p-value threshold of 0.05.
If there are no significant changes in the experiment, you will expect to see a distribution more like that on the left above while an experiment with significant changes will look more like that on the right. So, even if there are no significant changes in the experiment, we still expect, by chance, to get p-values < 0.05. These are false positives, and shown in red. Even in an experiment with significant changes (in green), we are still unsure if a p-value < 0.05 represents a true discovery or a false positive. Now, the q-value approach tries to find the height where the p-value distribution flattens out and incorporates this height value into the calculation of FDR adjusted p-values. We can see this in the histogram below. This approach helps to establish just how many of the significant values are actually false positives (the red portion of the green bar).
Now, the q-values are simply a set of values that will lie between 0 and 1. Also, if you order the p-values used to calculate the q-values, then the q-values will also be ordered. This can be seen in the following screen shot from Progenesis SameSpots. Notice that q-values can be repeated.
To interpret the q-values, you need to look at the ordered list of q-values. There are 839 spots in this experiment. If we take spot 52 as an example, we see that it has a p-value of 0.01 and a q-value of 0.0141. Recall that a p-value of 0.01 implies a 1% chance of false positives, and so with 839 spots, we expect between 8 or 9 false positives, on average, i.e. 839*0.01 = 8.39. In this experiment, there are 52 spots with a value of 0.01 or less, and so 8 or 9 of these will be false positives. On the other hand, the q-value is a little greater at 0.0141, which means we should expect 1.41% of all the spots with q-value less than this to be false positives. This is a much better situation. We know that 52 spots have a q-value less than 0.0141 and so we should expect 52*0.0141 = 0.7332 false positives, i.e. less than one false positive. Just to reiterate, false positives according to p-values take all 839 values into account when determining how many false positives we should expect to see while q-values take into account only those tests with q-values less the threshold we choose. Of course, it is not always the case that q-values will result in less false positives, but what we can say is that they give a far more accurate indication of the level of false positives for a given cut-off value.
When doing lots of tests, as in a proteomics experiment, it is more intuitive to interpret p and q values by looking at the entire list of values in this way rather that looking at each one independently. In this way, a threshold of 0.05 has meaning across the entire experiment. When deciding on a cut-off or threshold value, you should do this from the point of view of how many false positives will this result in, rather than just randomly picking a p- or q-value of 0.05 and saying that everything with a value less than this is significant.
本帖引用网址：http://bbs.bbioo.com/thread-50919-1-1.html
定量PCR仪新应用：SNP和基因突变检测
定量PCR仪最主要的功能是测定样品中DNA或RNA的浓度，但是也不仅仅局限于此。如果定量PCR仪的硬件和软件设计精良，具备多色检测能力，运用的又是分子生物学中应用广泛的基本原理，如TaqMan探针，就为用户灵活运用、开拓新的研究和 应用留下了很大余地，可以开展单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)研究、等位基因鉴定、基因突变检测、正/负检测等许多项目。因为TaqMan探针杂交本质上就是分子杂交，凡是用到分 子杂交的研究，都可以通过定量PCR来完成。
1 TaqMan探针技术原理
探针是与目标核酸序列专一性结合的核酸片段，用于探测、确认和定量样品中的目标序列。由于结合是特异的，检测出来的只能是目标序列，而不是其同源片段。当然这需要在设计探针时进行全基因组的同源性扫描(如BLAST)来保证。
如果希望检测基因中的点突变或SNP位点，要用到两条不同的探针：一条针对正常或主要的序列，一条针对突变或少数的序列。TaqMan探针杂交检测的原理 与Southern和Northern杂交一样。为了探测探针的存在，需要在探针上作一些标记，常用的如放射性核素、地高辛、生物素、荧光基团等。荧光标 记由于既安全又灵敏，是当前的标记主流。
为了区别，需要在不同的探针上标记不同颜色的荧光基团。为了只检测杂交成功的探针所产生的荧光信号，需要在探针上再加一个淬灭基团：探针完整时，报告基团 发射的能量被淬灭基团吸收，仪器检测不到信号；探针断裂后，两种基团相距遥远，无法淬灭，仪器才能检测到信号。这样的探针就是TaqMan探针。为了在探 针断裂与探针杂交之间建立联系，同时放大信号强度，需要利用PCR过程：一方面利用Taq酶的5’→3’链延伸活性，完成PCR，放大DNA；另一方面利 用其3’→5’核酸外切酶活性，在链延伸过程中同时切断探针，产生荧光信号。将探针置于两条引物之间，则Taq酶切断的探针都是与模板DNA杂交结合的； 而且，每生成一条PCR产物，切断一条探针，产生一个单位的荧光信号，所以信号强度与PCR产物数量同步增长。
SNP分析、基因突变检测、等位基因鉴定、正/负检测等应用虽然相去甚远，但共同点都是检测样品中的两种不同片段：不同的SNP多态、正常和突变的基因、 不同的等位基因等等，所以都可以应用TaqMan探针技术。作定量PCR，需要1对PCR引物和1条探针；作等位基因鉴定则需要1对引物和2条探针。定量 PCR是实时动态检测，确定CT值；等位基因鉴定只需要在PCR完成后检测总的荧光信号。这是它们之间的区别。
TaqMan探针的淬灭基团有两种：普通的TaqMan探针淬灭基团是TAMRA，它也发射荧光，构成本底的一部分；MGB探针则采用非荧光淬灭基团 (Non-Fluorescent Quencher，NFQ)，本身不发荧光，所以信噪比更高，探测更灵敏。MGB探针上另外还有一个MGB (Minor Groove Binder)基团, 它可以在不增加长度的情况下将探针的Tm值提高10°C左右，因此MGB探针可以设计得更短。这一方面降低了探针合成的成本，一方面也大大增加了探针设计 成功的机会。另外，实验证明，MGB探针对于富含A/T的模板可以区分得更为理想。
2 SNP分析
2.1 定义和分类
单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)是指在基因组水平上由单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，即基因组内特定位置上存在两种不同的碱基，其中少一种在群体中的频率不小于1%。
单个碱基的改变在人群中的发生频率(等位基因频率)只能在0%到50%之间。如果等位基因频率<1%，一般称为基因突变，而不是多态性；等于50%，称为杂合子；二者之间的才是多态性。绝大多数SNP是二态性的，只有2种等位基因。
SNP是人类可遗传变异中最常见的一种，占所有已知多态性的90%以上。人基因组平均每1000个碱基中就有1个SNP，至2002年6月，总数400多万个。
SNP主要根据它们在基因组中所处的位置和生物学效应分类，见表1。
表1 SNP分类
位 置 对基因功能的影响 类 型 生物学效应
编码区 沉默，如UUG CUG，都编码Leu。 sSNP 通常不改变表型。
编码区 导致氨基酸改变，如UUC UUA导致Phe Leu。这种SNP不多见但是最有价值，可能被专利保护。 cSNP 改变表型。由于氨基酸置换的类型和部位不同，作用微妙。
编码区 导致终止密码，如UCA UGA导致Ser Stop。 cSNP 改变表型。
调控区 提高或降低转录速率。 rSNP 可能改变表型。
其 他 最常见，对基因产物没有影响(?)，作为多基因遗传病的遗传标记。有人称之为Anonymous SNP。
如果cSNP或rSNP导致蛋白质的功能或表达发生变化，也称为pSNP。在人类基因组中，cSNP或pSNP约占全部SNP的2%，也就是大约8万个。
2.2 研究意义
SNP的应用范围较微卫星标记更加宽广，对群体遗传学、制药业、法医学、癌症及遗传性疾病甚至进化的研究都将产生不可估量的影响。人们希望通过研究SNP图谱，更深刻地认识癌症、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等发病率高的多基因疾病的发生机制。
(1) 遗传病致病基因的连锁定位
SNP作为遗传标记，可以用来进行单基因和多基因遗传病的连锁分析(linkage analysis)或关联分析(association analysis)。在疾病易感基因的定位方面，SNP的定位精度比微卫星标记精细得多，可以直接用于指导易感基因克隆。
人类的遗传连锁图谱至今已发展到了第三代。第一代是限制性片段长度多态性(RFLP)图谱，第二代是微卫星图谱，第三代是SNP图谱。SNP的优点在于： (1) SNP是二态性的，在任何人群中其等位基因频率都可估计出来；(2) SNP在基因组中的分布比微卫星标记更广泛；(3) SNP是相对稳定的，而STR的高突变率容易导致在人群遗传分析时出现困难；(4)部分SNP会直接影响到蛋白质结构或基因表达水平，本身可能就是疾病遗传机制的候选改变位点。
(2) SNP与药物遗传学和药物基因组学
个体化用药。同一种药物，对不同的病人治疗效果有时差异显著。造成这种差异的原因是由于药物在不同的个体内活化、代谢和清除等方面的基因差异所决定的，这 种差异主要是SNP。研究SNP与药物的个体敏感性或耐受性之间的关联，可以阐明与药物疗效以及毒副作用相关的SNP基因型，从而为针对性地使用药物提供 依据。这就是所谓的“药物百家姓”。
为寻找新药提供依据。药物基因组学研究遗传因素对药物作用的影响和不同基因型个体对药物反应的差异，从而为根据不同基因型群体对药物的反应来改进药物设计 提供理论依据。这是当前制药行业对SNP表现出空前兴趣的原因。目前FDA在批审的新药中至少有15种新药要求进行病人的基因分型。
2.3 SNP基因分型的研究方法
SNP研究分为3个阶段：发现，常用重复测序和in silico分析技术；确认并测算其等位基因频率，常用单碱基延伸技术；筛查，也就是开展与SNP有关的研究项目，一般采用5’核酸酶试验和MGB探针技术。
SNP基因分型研究方法的选择应该从以下几个方面进行评估：准确性、操作自动化程度、通量高低和每一个样本的分析成本。考虑这些因素，荧光定量PCR是临 床基因分型研究的首选技术平台。准确：TaqMan MGB探针的长度只需13-18个碱基，一个碱基的不同可以使两种探针的Tm值相差18度，检测SNP的准确性极高。方便：操作与PCR一样，是所有分型 方法中最简便的，而且是目前唯一的一步扩增即可完成的SNP基因分型方法。试剂盒商品化：如ABI公司提供20万个位点的SNP基因分型试剂盒，构成一个 以功能基因为中心的、高分辨率的定位标记图谱，是疾病研究、侯选药物筛选和药物疗效关联研究的有力工具。
2.4 TaqMan探针技术在SNP研究中的应用
在SNP基因分型的PCR反应体系中包括1对引物和2条探针。这2条探针分别针对SNP的两种等位基因，并分别被标记上不同颜色的荧光基团。如果使用 ABI公司的Assays-on-Demand试剂盒，实验操作非常简单：加入基因组DNA，PCR 预混液和Assays-on-Demand试剂盒（内含所需的引物和探针），即可在7000或7900上按标准的反应循环条件作PCR。在PCR完成后， 仪器根据检测到的荧光信号的颜色来自动判断样品中存在哪种等位基因，给出结果。结果总共有3种可能：两种等位基因各自的纯合子和杂合子。只有一种信号出现 是纯合子，如果两种信号同时出现，就是杂合子。典型的SNP筛查结果见图3(略）。
3 基因突变检测、等位基因鉴定和+/-检测
这些应用在技术原理上和PCR操作上与SNP研究几乎一样，其PCR反应体系中也包括1对引物和2条探针，其区别仅仅是生物学意义上的，也就是研究的目的 和对实验数据的解释不同。基因突变检测是分析样本中的某个基因是正常的还是带有已知的点突变；等位基因鉴定是分析样本中存在哪种等位基因；+/-检测则分 析样本中某个特定基因或核酸片段的有无——都是通过分别针对两种等位基因探针及其荧光标记颜色来实现的。一般地说，包括SNP研究在内，所有这些应用都可 以统称为等位基因鉴定。
所有的等位基因鉴定实验，包括SNP分析和点突变测定，都要求定量PCR仪具备多色检测能力，能够在同一个反应管中同时检测多个荧光信号，具体地说就是， 至少2种报告荧光信号，外加1种淬灭荧光信号和1种参比校正荧光信号，总共4种。否则的话，如果仪器只有单色检测能力，即使能够将同一个样本分成两份，进 行两次检测，还少了校正信号，无法消除取样量等偶然误差，既增加了费用，又降低了等位基因判定的可信度。
4 荧光信号的归一化
等位基因鉴定也要注意实验数据的归一化，特别是荧光信号强度的校正，以保证结果的严格可靠。
加样操作误差、离心管盖透光性能差异、不同反应管之间荧光激发效率差异等偶然因素实际上不可避免，仪器收集到的原始信号必然有波动，只有在归一化之后，才 可以相互比较并保证重现性。这种校正是通过在反应缓冲液中添加校正荧光(通常是ROX)来实现的。ROX在缓冲液中的浓度是固定的，因此其信号强度与反应 体积和荧光激发效率等各种因素的总和正相关。仪器同时收集反应信号和校正荧光信号，然后反应信号除以校正信号，消除上述误差的影响，极大地提高了等位基因 判定的准确度。
无论忽视ROX校正的重要性，还是由于所使用的定量PCR仪没有多色检测能力而不做ROX校正，都是不严格的。
1. 先看综述，后看论著.看综述搞清概念，看论著掌握方法。
2. 早动手在师兄师姐离开之前学会关键技术。
3. 多数文章看摘要，少数文章看全文.掌握了一点查全文的技巧，往往会以搞到全文为乐，以至于没有时间看文章的内容，更不屑于看摘要。真正有用的全文并不多，过分追求全文是浪费，不可走极端。当然只看摘要也是不对的。
4. 集中时间看文献.看过总会遗忘。看文献的时间越分散，浪费时间越多。集中时间看更容易联系起来，形成整体印象。
5. 做好记录和标记复印或打印的文献，直接用笔标记或批注。pdf 或html 格式的文献，可以用编辑器标亮或改变文字颜色。这是避免时间浪费的又一重要手段。否则等于没看。
6. 准备引用的文章要亲自看过。转引造成的以讹传讹不胜枚举。
7. 注意文章的参考价值。刊物的影响因子、文章的被引次数能反映文章的参考价值。但要注意引用这篇文章的其它文章是如何评价这篇文章的：支持还是反对，补充还是纠错。
8. 交流是最好的老师。做实验遇到困难是家常便饭。你的第一反应是什么？反复尝试？放弃？看书？这些做法都有道理，但首先应该想到的是交流。对有身份的人，私 下的请教体现你对他的尊重；对同年资的人，公开的讨论可以使大家畅所欲言，而且出言谨慎。千万不能闭门造车。一个实验折腾半年，后来别人告诉你那是死路， 岂不冤大头？
9. 最高层次的能力是表达能力。再好的工作最终都要靠别人认可。表达能力，体现为写和说的能力，是需要长期培养的素质。比如发现一个罕见病例，写好了发一篇论 著；写不好只能发一个病例报道。比如做一个课题，写好了发一篇或数篇论著；写不好只能发一个论著摘要或被枪毙。一张图,一张表,无不是表达能力的体现。寥 寥几百上千字的标书，可以赢得大笔基金；虽然关系很重要，但写得太差也不行。有人说，我不学PCR，不学spss，只要学会 ppt（powerpoint）就可以了。此话有一点道理，实验室的boss 们表面上就是靠一串串ppt 行走江湖的。经常有研究生因思维敏捷条例清楚而令人肃然起敬。也经常有研究生不理解”为什么我做了大部分工作而老板却让另一个没怎么干活的人写了文章？让他去大会发言？”你没有看到人家有张口就来的本事吗？
10. 学好英语，不学二外。如今不论去日本还是欧洲，学术交流早已是英语的天下。你不必为看不懂一篇法语的文章而遗憾，写那篇文章的人正在为没学好英语而犯愁。如果英文尚未精通，暂且不要去学二外。
英文文章写作
1. 阅读10 篇文献，总结100 个常用句型和常用短语。经常复习。注意，文献作者必须是以英文为母语者，文献内容要与你的专业有关。这属于平时看文献的副产品。
2. 找3-5 篇技术路线和统计方法与你的课题接近的文章，精读。写出论文的草稿。要按照标题、作者、摘要、背景、目的、材料、方法、结果、讨论、致谢、参考文献、图例、图、表、照片和说明的统一格式来写。这样做的好处是从它可以方便地改成任何杂志的格式。
3. 针对论文的每一部分，尤其是某种具体方法、要讨论的某一具体方面，各找5-8 篇文献阅读，充实完善。这里讨论的只涉及英文表达，也只推荐给缺乏英文写作经验的人。
4. 找到你想投的杂志的稿约，再找2-3 篇该杂志的article，按它的格式改写。注意，每次改写都要先另存为不同的文件名，以免出了问题不能恢复。
5. 找英文高手改。找不到合适的人，就去找提供英语论文编辑服务(English correction and improvement，not translation)的公司，在此向有钱没时间的人强烈推荐。
文献管理
1. 下载电子版文献时（caj，pdf，html），把文章题目粘贴为文件名。注意，文件名不能有特殊符号，要把 \ / : * ? < > | 以及 换行符删掉。 每次按照同样的习惯设置文件名，可以防止重复下载。
2. 不同主题存入不同文件夹。文件夹的题目要简短，如：PD，LTP,PKC，NO。
3. 看过的文献归入子文件夹，最起码要把有用的和没用的分开。
4. 重要文献根据重要程度在文件名前加001,002，003 编号，然后按名称排列图标，最重要的文献就排在最前了。
5. 复印或打印的文献，用打孔器（￥10-15）打孔，装入硬质文件夹（￥10-20/个）。
我们经常会在参考文献的引用上耍一些小聪明，殊不知这些都会降低论文质量。
1. 知而不引明明借鉴了同行的类似工作，却故意不引用同行的类似工作，使自己工作看上去”新颖””领先”。实际上审稿的可能就是同行。
2. 断章取义故意截取作者试图否定的部分来烘托自己的观点。
3. 引而不确没有认真看原文，引文错漏。
4. 来源不实某些字句来源不可靠(比如非正式的或非学术的出版物)，且不注明来源。常见于一些统计数字。
5. 盲目自引不是为了说明自己的工作与前期工作之间的关系，而是单纯为提高自己文章被引用次数而自引。
国内文章水平不高的几个原因：
1. 审稿人知识陈旧年纪大的审稿人查文献和和上网的能力相当有限，无法核实该研究是否有意义，创新点在那里，方法是否可靠，结果是否可信。但匪夷所思的是他们经常提的审稿意见是”参考文献不够新”。
2. 选错审稿人虽然一般指定两名审稿人，但编辑部经常让不懂分子生物学的人审分子生物学的文章，让不懂统计的人审统计处理比较复杂的文章。出于爱面子，很少有人提出”我不适合审这篇文章”。
3. 关系文章有了关系，什么都简单了。
4. 不承认阴性结果。诚实的阴性结果被认为无意义。怪不得有人大声疾呼”我要办一本阴性杂志”。
5. 造假。任何人都不愿意成为制度的牺牲品。出不来预期结果就没法交差。为生存计，为按期毕业计，造吧。
动态的科学
1. 科研靠积累。象伦琴发现X 射线那样凭借一次简单观察就得诺贝尔奖的机会越来越少。更多的科研成果来自于实验室长期积累。最终实至名归。 做科研不要指望一步登天。设计课题不要好高骛远。基金评审也是这样。没有前期积累，获得资助的可能性小。选导师要想好：你是要白手起家，还是要为人作嫁？
2. 文献要追踪。开题时通过查文献了解的情况，到结题的时候可能有很大不同。实验过程中要注意追踪。运气好，你可以得到更多的线索；运气不好，发现别人抢先了。据此修正你的实验。写论文之前一定要重新查一遍文献。
3. 记录要复习。前面的实验记录要经常复习。随着经验的增加和认识的提高，你会发现最初的判断未必正确。
我曾经向一些比我有经验的人请教”什么是科研”，他们没有正面回答我，只是给我打了五个比方。
1. 科研是流行歌曲。什么流行用什么，什么流行做什么。张口生物芯片，闭口纳米技术。老板是追星一族，流行的就是最好的。
2. 科研是移花接木。设计课题？课题怎么是设计出来的呢？是拼出来的。A 的材料，B 的方法，C 的指标，D 的意义。
3. 科研是傻瓜相机。原理搞不懂？恕我老朽，没时间看原理了。我能折腾，多折腾几次就出来了。为什么要做这一步？老板心里明白就行了！他每周安排的活儿我还干不完呢。
4. 科研是照葫芦画瓢。综述不会写？抄啊。论文不会写？套啊。反正不会有人追究。无知者无畏！
5. 科研是垃圾。实验完成了，论文发表了，答辩通过了。老板语重心长地说：”你们走后，这些都是垃圾”。晕！倒！挣扎！再倒！他们没有骗我，实用主义自有它的道理。但我从此不再随便批判国内的科研水平了，因为在某些时候我也重复着同样的故事。
写毕业论文
1.先列提纲不列提纲，上来就写，是坏习惯。几百字没问题，几千字勉强，几万字就难了。必须列出写作提纲，再充实完善，以保证思路的连贯和字数的均衡。
2. 平时多写及时总结阶段性的工作，多写文章多投稿。到最后阶段，把这些文字有机地组合起来，就是一篇很好的毕业论文。
3. 不要罗列所有数据为了保证毕业论文的分量，研究生往往会观测较多的指标。但毕业论文并非数据越多越好。一定要舍弃那些与主旨关系不大的数据。否则，要么显得累赘松散，要么成为破绽。
4. 打印修改在电脑上直接修改，会遗漏很多错误。要尽可能地减少任何错误，一定要打印出来修改。
5. 让别人指出错误自己修改，仍然受个人习惯的局限。错误摆在那里，却熟视无睹。让别人给你指出错误吧，不管他与你是不是同一专业。
怎样读文献
1. 目标：漫无目的则毫无效率，抓不住重点才效率低下。选题之前可能会有一段时间处于迷茫状态，不知从哪入手。胡乱看了大量文献，却不知所以然。在导师的指导下，在同行的启发下，有些人可以迅速明确目标，有的放矢，入门就从这里开始。即使导师不导，没有定题，自己也要先设定一个具体的问题看文献。不管你将来做不做这些东西，总比没有目标好得多，保证有收获。科研的一般法则是共通的。
2. 层次：对于一个具体的课题来说，相关文献分属于三个层次：研究方向、研究领域、研究课题。例如有人研究干细胞定 向分化治疗帕金森病，对他来说，研究方向就是帕金森病，研究领域是帕金森病的干细胞治疗，研究课题是某种物质诱导干细胞定向分化为分泌多巴胺的神经细胞。 看文献时要分清手上的文献是属于那个层次，这决定你对它要掌握到什么程度。研究方向层次的文献：一般涉及，基础知识，学科水准，了解当前重大进展与趋势，达到专业人员水平；研究领域层次的文献：了解焦点与热点，已/正/将进行的课题，达到专家水平；研究课题层次的文献：要全面，了解历史、现状、展望、主要方法、手段，达到No1专家水平。正确分辨文章的层次，才能把精力用到点子上。
3. 形式：广义的文献包括可以阅读的所有出版形式。教科书、专著、会议摘要汇编、期刊、网页、甚至ppt文件。比如要了解免疫应答的基本形式，最好是看教科书；要参考大鼠脑立体定位图谱，最好是看专著；要知道最新进展，最好是查阅期刊；要了解别人的研究动向，最好是参会或看会议论文汇编。不要找错信息源。
4. 程度：对文献的熟悉程度不同，阅读文献的方式大不相同。新手学习式阅读，逐字逐句，搞清细节，掌握最基本的知识点。最初的十几、几十篇要精读，精华的几篇 甚至要背诵。老手搜索式阅读，已熟悉各种研究的常见模式和一般套路，能够迅速提取关键信息，把握思路，经常不按常规顺序阅读。有人看图说话，有人辨数识 字。高手批判式阅读，一针见血，直指问题所在。实际上没有一篇论文是无懈可击的。新手要稳，老手要准，高手要狠。新手、老手、高手的代表人物分别是研究 生、导师和审稿人，但认真钻研的研究生完全可以在3年中实现从新手到高手的嬗变。对自己有清醒的定位，才能选择正确的阅读方式。
5. 矛盾：文献读的多了，脑子里塞满了信息。公说公有理，婆说婆有理，反而无所适从？为了解决这个问题，循证医学划 分临床试验证据的等级；同理，我们看文献也要重视实验证据的强度。发现矛盾，是第一步；找出异同，是第二步；思考解决，是第三步。从相互矛盾的结论推导中 发现矛盾的根源，此时如能跳出圈外，不走思维定势，从原始的科学问题出发，”无招胜有招”，真正是到达另外一种境界了。何必翻译外国人的综述谎称自己的综 述？何必重复别人做过的实验谎称自己的思路
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